Pembalap KTM Factory, Pedro Acosta, meraih posisi teratas dalam tes terakhir musim 2025 di Misano, sementara Yamaha melakukan uji coba motor MotoGP bertenaga V4 terbaru mereka. Acosta berhasil menempati posisi teratas dengan waktu 1 menit 30,374 detik, setelah sebelumnya menempati posisi kedua di sesi uji coba tersebut. Pada posisi kedua, Alex Marquez dari Gresini Racing, diikuti oleh Marco Bezzecchi dan Raul Fernandez di posisi ketiga dan keempat. Pada posisi kelima, Franco Morbidelli dari motor VR46 finis di belakang Fernandez. Juara bertahan, Jorge Martin, menyelesaikan 60 lap dan meraih posisi kesembilan dengan waktu terbaik 1 menit 30,945 detik.
Yamaha menjadi fokus utama dalam tes ini dengan membawa dua motor M1 bertenaga V4 untuk uji coba yang akan digunakan di GP San Marino. Pembalap Gresini Ducati, Fermin Aldeguer, berhasil meraih posisi ke-10. Sementara itu, pembalap pabrikan Honda, Luca Marini, finis di urutan ke-11 dengan selisih waktu 0,609 detik dari Acosta. Quartararo, Rins, dan Miller adalah pembalap yang berhasil mencoba motor baru V4 Yamaha, dengan Quartararo mengungkapkan kekecewaannya terhadap performa motor baru tersebut.
Honda dan Aprilia juga melakukan pembaruan pada motor mereka, sementara KTM menguji knalpot dan swingarm baru. Ducati yang tertutup mengenai rencana pengujiannya membandingkan paket aero terbaru dengan yang digunakan sebelumnya. Rencananya, dua pembalap absen dalam tes tersebut, yaitu Joan Mir dan Ai Ogura, untuk pulih dari cedera yang mereka alami di GP San Marino. Dani Pedrosa, Michele Pirro, dan Takaaki Nakagami mewakili pabrikan mereka dalam uji coba tersebut. Selain itu, Augusto Fernandez tidak ikut serta untuk memberikan kesempatan bagi pembalap pabrikan Yamaha untuk menguji motor V4.
